Pages

Sunday, January 16, 2011

Pengaruh ZPT BAP Dan Kinetin Pada Eksplan Daun Krisan


Setelah dilakukan pengamatan selama 21 hari, terlihat perubahan pada eksplan. Pada saat inokulasi eksplan terlihat rata pada medium, tetapi setelah dua minggu pengamatan bagian tepi eksplan mulai mengkerut dan terangkat ke permukaan sehingga eksplan terlihat sedikit cekung. Hasil ini menunjukkan bahwa eksplan mengalami pertumbuhan. Hasil ini juga membuktikan bahwa sitokinin yang dalam hal ini adalah BAP dan Kinetin berperan pada proses pembelahan sel. Meskipun pada praktikum ini tidak ditambahkan hormon auksin, sel tetap dapat melakukan pemanjangan karena menurut Gunawan (1987) dalam Zulkarnain (2009) setiap organ atau jaringan tumbuhan selalu mengandung hormon endogennya meskipun dalam konsentrasi yang terbatas.
Setelah mengalami perubahan yang cukup signifikan, eksplan tersebut tidak mengalami perubahan yang berarti lagi hingga pengamatan terakhir (Hari ke 21) yang berarti eksplan tidak dapat membentuk kalus secara sempurna. Hal ini diindikasikan karena tidak sebandingnya konsentrasi zat pengatur tumbuh (hormon eksogen) dan fitohormon (hormon endogen) pada eksplan. Telah dikatakan sebelumnya bahwa pada praktikum ini digunakan zat pengatur tumbuh BAP dan Kinetin dimana keduanya merupakan kelompok dari hormon sitokinin dimana fungsinya secara umum adalah menginduksi pembelahan sel dan pada kultur in vitro hormon tersebut berperan pada proses pembentukan tunas. Akan tetapi pada praktikum ini diharapkan eksplan tersebut terdiferensiasi menjadi kalus, sehingga dibutuhkan kombinasi antara zat pengatur tumbuh dari jenis yang berlainan yaitu auksin dan sitokinin (dan di sini diasumsikan jaringan tumbuhan memiliki konsentrasi hormon endogen yang seimbang).
Menurut Campbell (2002), sebuah jaringan yang dikulturkan dengan konsentrasi auksin dan sitokinin yang seimbang akan membentuk kalus, jika konsentrasi sitokinin lebih tinggi dibanding auksin akan terbentuk tunas, dan jika konsentrasi sitokinin lebih rendah dibanding auksin akan terbentuk akar. Oleh karena itulah, eksplan daun krisan pada praktikum ini hanya mengalami perubahan pada hari-hari pertama setelah inokulasi dan tidak mengalami perubahan hingga pengamatan terakhir. Hasil ini membuktikan pula bahwa hormon tumbuhan tidak dapat bekerja sendiri-sendiri, tetapi selalu bekerja sama dengan jenis hormon lainnya dimana konsentrasi antara hormon yang satu dan yang lain tergantung pada jenis tanaman dan organ atau bagian tumbuhan yang dipengaruhinya sehingga dapat dishasilkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman secara seimbang.

Sterilisasi Dan Inokulasi Eksplan (Daun Krisan)


Eksplan: daun muda tanaman krisan (Chrysanthemum indicum). 
Pemilihan eksplan ini didasarkan atas banyaknya jaringan meristem pada suatu organ tumbuhan muda dimana jaringan meristem inilah yang aktif membelah dan akhirnya terdiferensiasi menjadi jaringan tumbuhan lain yang pada akhirnya akan membentuk organ tumbuhan (Zulkarnain, 2009). Eksplan daun krisan selanjutnya dicuci dengan air mengalir sembari digosok permukaannya dengan menggunakan sikat halus. Hal ini bertujuan untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi karena permukaan daun krisan mengandung kutikula dimana hal tersebut dapat diketahui dari teksturnya yang kasar dan berbulu. Pencucian eksplan daun krisan ini merupakan sterilisasi eksplan tahap pertama.
            Eksplan daun yang telah dicuci selanjutnya dibawa ke laminair air flow untuk dilakukan sterilisasi tahap kedua. Eksplan daun direndam dalam etanol 70% selam 30 detik untuk melunakkan dinding sel pada daun sehingga sterilan berikutnya dapat masuk ke dalam jaringan eksplan dan menghilangkan kontaminan yang ada dalam jaringan. Karena menurut Gunawan (1987), kontaminan tidak hanya dapat berasal dari permukaan luar eksplan, tetapi juga dari dalam jaringan eksplan. Selanjutnya eksplan direndam dalam larutan clorox 1% dan dibilas dengan aquades steril. Larutan clorox ini adalah salah satu larutan sterilan dimana penggunaannya pada sterilisasi eksplan termasuk sterilisasi ringan. Menurut Gunawan (1987) berdasarkan senyawa kimia yang digunakan, sterilisasi eksplan dibedakan menjadi tiga, yaitu:
  • 1.      Sterilisasi Ringan
Eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali. 
  • 2.      Sterilisasi Sedang
Eksplan direndam dalam HgCl2 0.1-0.5 mg/l selama 7 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali.  
  • 3.       Sterilisasi Keras
Eksplan direndam dalam HgCl2 0.1-0.5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril.  Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali.   
Selain berdasarkan jenis senyawa kimianya, sterilisasi eksplan dibedakan menjadi sterilisasi kimia dan mekanik. Sterilisasi kimia adalah sterilisasi ekaplan dengan menggunakan senyawa kimia seperti clorox ataupun sublimat dimana sterilisasi ini digunakan pada eksplan yang teksturnya lunak seperti daun atau nodus. Sedangkan sterilisasi mekanik merupakan teksnik sterilisasi eksplan yang dilakukan dengan melukai eksplan (skarifikasi) dimana material eksplan yang digunakan bersifat keras, seperti biji salak atau kelengkeng. Teknik sterilisasi mekanik ini, selain untuk menghilangkan kontaminan dilakukan juga untuk mematahkan dormansi pada biji (Salisbury dan Ross, 1995). Dari penjabaran tersebut maka dapat dikatakan bahwa sterilisasi yang digunakan pada eksplan krisan ini merupakan sterilisasi kimiawi dengan larutan clorox 1% sebagai bahan sterilannya. Suhu 121°C. Sterilisasi ini merupakan sterilisasi dengan menggunakan uap air sehingga dinamakan sterilisasi uap basah (Waluyo, 2008). Setelah diautoclave, alat-alat disterilisasi dengan sinar UV yang ada pada laminair air flow selama 1 jam penuh dimana ketika lampu UV dinyalakan, tirai LAF ditutup rapat. Selain itu dilakukan pula sterilisasi secara langsung terhadap alat-alat inokulasi dimana setiap kali hendak digunakan alat-alat inokulasi dilalukan di atas api bunsen. Teknik sterilisasi yang demikian dinamakan sterilisasi panas kering. Pada alat inokulasi dilakukan pula sterilisasi secara kimiawi dimana setelah digunakan untuk memberikan perlakukan pada eksplan, misalnya memotong eksplan, alat tersebut dicelupkan ke dalam larutan etanol atau alkohol 90% selama satu menit.


Setelah melalui tahap sterilisasi tersebut, eksplan daun krisan selanjutnya ditiriskan di atas kertas saring dan dipotong kecil-kecil dengan ukuran 1 x 1 cm2. Pemotongan eksplan dilakukan setelah sterilisasi dikarenakan konsentrasi sterilan tersebut dikhawatirkan terlalu pekat bagi jaringan eksplan yang telah dipotong sehingga eksplan tidak lagi hidup (mati). Eksplan tersebut kemudian dinokulasikan ke dalam medium MS dengan bagian abaksial daun menyentuh permukaan medium. Hal ini dikarenakan pada bagian baksial, letak jaringan pengangkut lebih dekat dengan permukaan dibandingkan bagian adaksial (atas) daun dimana pada bagian adaksial setelah jaringan epidermis terdapat jaringan mesofil sehingga penyerapan unsur hara dari medium dapat berlangsung optimal. Setelah inokulasi selesai, eksplan diinkubasi di ruang kultur selama 21 hari untuk mengetahui pengaruh ZPT yang telah diberikan pada medium. Pengamatan 21 hari ini merupakan waktu minimum bagi eksplan untuk melakukan suatu pertumbuhan yang dalam hal ini adalah membentuk kalus.

STERILISASI EKSPLAN


Sterilisasi adalah proses untuk mematikan atau menonaktifkan spora dan mikroorganisme sampai ke tingkat yang tidak memungkinkan lagi berkembang biak atau menjadi sumber kontaminan selama proses perkembangan berlangsung. Sterilisasi eksplan dapat dilaksanakan dengan dua cara, yaitu secara mekanik dan secara kimia. Sterilisasi eksplan secara mekanik digunakan untuk eksplan yang keras (misalnya tebu, biji salak, dan sebagainya) atau berdaging (misalnya wortel, umbi, dan sebagainya), yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spiritus sebanyak tiga kali. Sedangkan sterilisasi eksplan secara kimia digunakan untuk eksplan yang lunak (jaringan muda) seperti daun, tangkai daun, anther, dan sebagainya. Bahan-bahan kimia yang sering digunakan untuk sterilisasi permukaan eksplan antara lain:
1.  Sodium hipoklorit
Nama dagangnya adalah clorox  dan bayclin. Konsentrasi untuk sterilisasi tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5%-20% dan waktunya antara 5-10 menit.
2.  Mercuri klorit
Nama dagangnya adalah sublimat 0.05%. Penggunaan bahan kimia ini harus hati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasinya sama dengan clorox, hanya waktunya lebih pendek karena sublimat bersifat keras. 
3.  Alkohol 70%
Alkohol lebih banyak diperdagangkan dalam bentuk alkohol 95%. Jamur biasanya mati dengan alkohol 70%, sedangkan dengan alkohol 95% masih tetap hidup.
Dari ketiga bahan kimia tersebut,  perlakuan sterilisasinya biasanya dilakukan di dalam  laminar air flow cabinet. Untuk perlakuan sterilisasi di luar laminar air flow cabinet biasanya menggunakan fungisida dan bakterisida (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Menurut Gunawan (1987) ada sekitar sepuluh jenis bahan yang digunakan dalam sterilisasi permukaan, yaitu kalsium hipoklorit, natrium hipoklorit, hidrogen peroksida, gas klorin, perak nitrat, merkuri klorid, betadin, fungisida, antibiotik, dan alkohol.