Perkecambahan Kultur Biji Anggrek

Perkecambahan adalah munculnya individu baru dari suatu biji tanaman. Peristiwa ini merupakan salah satu tahapan pada siklus hidup tumbuhan. Tidak hanya secara in vivo, perkecambahan juga dapat dilakukan secara in vitro melalui teknik kultur jaringan dimana prosesnya lebih sering disebut sebagai kultur organ (biji). Nurfadilah (2011) mengemukakan bahwa pada saat dikulturkan secara in vitro biji anggrek mengalami 5 fase Fase 0 (nol) merupakan fase awal dimana biji belum terlihat berkecambah. Selanjutnya fase 1 yaitu tahapan dimana biji membentuk protokom. Protokom adalah struktur bulat padat berwarna hijau yang nantinya akan membentuk organ pada perkembangan embrio selanjutnya. Setelah fase 1, biji akan mengalami fase 2 yang ditandai dengan membesarnya protokorm dan terbentuknya primordia daun. Kemudian biji akan mengalami fase 3 dimana protokorm mulai membentuk daun dan akar yang pertama. Selanjutnya akan terlihat beberapa helaian daun-daun kecil beserta akar yang menandakan pertumbuhan biji berada pada fase 4. Tahapan perkembangan yang terakhir adalah terbentuknya tanamana kecil atau planlet yang merupakan fase 5 sekaligus fase tahapan terakhir dari pertumbuhan dan perkembangan awal suatu biji anggrek.

Sterilisasi Dan Inokulasi Eksplan Daun Anggrek

a. Sterilisasi Eksplan

Sterilisasi permukaan eksplan daun anggrek terdiri dari dua tahap yaitu sterilisasi tahap I yang dilakukan di ruang persiapan dan sterilisasi tahap II yang dilakukan di laminair air flow (LAF). Pada sterilisasi tahap I, daun anggrek diambil dari greenhouse dan dicuci dengan air mengalir selama beberapa menit, setelah itu dilakukan sterilisasi tahap II ,eksplan daun muda anggrek  dicelupkan pada ethanol 70% selama 1 menit kemudian dicuci dengan aquades steril, selanjutnya eksplan disterilkan dalam sodium hypochlorit konsentrasi 10% selama 5 menit kemudian disterilkan dalam konsentrasi 5% selama 10 menit, lalu dicuci dengan aquades steril secara bertingkat sebanyak 3 sampai 4 kali. Selanjutnya eksplan diambil dengan pinset dan ditiriskan pada kertas saring steril (Hendaryono, 1994).

b. Inokulasi Eksplan

Eksplan dipotong dipotong dengan ukuran ± 1cm² dengan ketebalan ± 1mm. Daun diiris melintang menggunakan scalpel tajam dan steril. Media dibuka penutupnya, mulut botol media diarahkan pada api bunsen lalu eksplan ditanam dipermukaan media sebanyak 1 eksplan. Eksplan ditanam dengan posisi bagian perlukaan kontak dengan medium. Botol media ditutup menggunakan alumunium foil dan plastik dan diikat dengan karet. Media yang berisi eksplan diinkubasi di rak kultur dan diberi penyinaran 16 jam photoperiod dibawah suhu 25±1^oC (Park et al, 2002).

Setelah eksplan diinokulasikan ke dalam botol kultur, botol ditutup rapat dan diberi label yaitu tanggal dilakukan inokulasi, setelah itu dilakukan inkubasi dan diamati perkembangan plb sesuai waktu penelitian.

Fungsi Arang Aktif (Charcoal) Pada Medium Kultur

Arang aktif atau charcoal adalah arang yang sudah dipanaskan selama beberapa jam dengan menggunakan uap atau udara panas (George & Sherrington, 1984). Bahan ini mempunyai sifat adsorpsi yang sangat kuat. Arang aktif dapat ditambahkan ke dalam media pada berbagai tahap perkembangan kultur. Bahan ini dapat ditambahkan pada media inisiasi, media regenerasi, atau media perakaran.

Penambahan arang aktif dapat membantu pertumbuhan perkembangan kultur, tergantung dari jenis kulturnya. Secara umum, pengaruh arang aktif adalah sebagai berikut:

1.   Mengadsorpsi persenyawaan-persenyawaan toxic yang terdapat dalam media yang dapat menghambat pertumbuhan kultur, seperti :

1. Persenyawaan-persenyawaan fenolik dari jaringan yang terluka waktu inisiasi.
2. Persenyawaan 5-hidroksimetil furfural yang diduga terbentuk dari gula yang berada dalam larutan asam lemah dan mengalami pemanasan dengan tekanan tinggi  

(Nitsch et al, 1968 dalam Gunawan 1988).

2.   Mengadsorpsi zat pengatur tumbuh sehingga:

1. Mencegah pertumbuhan kalus yang tidak diinginkan, seperti dalam androgenesis dan pucuk yang ingin diakarkan.
2. Membantu embryogenesis kultur dalam media regenerasi tanpa auksin, mungkin dengan bertindak sebagai sink yang menarik auksin dari dalam sel sehingga embryogenesis dapat terjadi

(Drew, (1979 dalam George & Sherringtone, 1984).

3.   Merangsang perakaran dengan mengurangi tingkat cahaya yang sampai ke bagian eksplan yang terdapat dalam media.

Arang aktif ditambahkan dengan konsentrasi yang bervariasi yakni 0.5-6 %, tergantung dari tujuan. Dalam media yang ditambahkan arang aktif, harus diusahakan agar arang aktif terbagi rata dalam media. Sesudah sterilisasi dalam autoklaf  botol media harus sering dikocok sampai agar  mulai membeku. Bila tidak diadakan pengocokan, maka hampir semua arang aktif berada di lapisan bawah media (George, 1984).

Macam Media Kultur

Ada beberapa macam media dasar yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemu, antara lain :

1.Medium Dasar Murashige dan Skoog (MS) : digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman herbaceous. Media ini mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO₃^- dan NH₄⁺

2.Medium dasar B5 atau Gamborg : digunakan unutk kultur suspensi sel kedele, alfafa dan legume lain.

3.Medium dasar White : digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.

4.Medium Vacin Went (VW) : digunakan khusus untuk medium anggrek.

5.Medium dasar Nitsch dan Nitsch : digunakan untuk kultur tepungsari (pollen) dan kultur sel

6.Medium dasar Schenk dan Hildebrandt : digunakan untuk kultur jaringan tanaman monokotil.

7.Medium dasar Woody Plant Medium (WPM) : digunakan untuk tanaman yang berkayu

8.Medium dasar N6 : digunakan untuk tanaman serealia terutama padi.

TERMINOLOGI

Agar                       produk yang terbuat dari alga yang digunakan untuk memadatkan medium kultur jaringan

Alkohol                  etil alkohol (C₂H₅OH), disebut pula etanol

Antiseptis                proses atau prinsip yang memanfaatkan antiseptik

DNA                      suatu bahan genetik yang terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup

Aseptik             bebas dari segala bentuk mikroorganisme (jamur, bakteri, ragi, virus, mikroplasma, dan sebagainya)

Auksin                  hormon yang menyebabkan pemanjangan sel, dominansi pucuk, dan inisiasi akar, misalnya asam indol asetat (IAA)

Bebas patogen      tanamn, meristem, jaringan, atau sel yang bebas dari penyebab penyakit (bakteri, jamur, virus, dan lain-lain)

Bebas penyakit       tanaman yang dinyatakan bebas dari patogen spesifik setelah pengujian yang spesifik

Diferensiasi                 istilah yang digunakan untuk menggambarkan pembentukan berbagai tipe sel, akar, pucuk, embrio, ataupun organ lain yang berbeda di dalam kultur kalus atau kultur sel

Dominansi pucuk        fenomena tertekannya pertumbuhan tunas aksilar oleh adanya tunas terminal pada suatu cabang

Eksplan                       organ atau sepotong jaringan yang digunakan untuk memulai kultur

Embrio                      tanaman yang sangat muda, berkembang di dalam gametofit betina dengan atau tanpa pembuahan

Embriogenesis             proses inisiasi dan perkembangan embrio

Erlemeyer                    suatu wadah kultur berbentuk kerucut dengan bagian bawahnya datar

Giberelin            suatu kelompok hormon tanaman yang berperan antara lain dalam pembelahan dan pemanjangan sel

Hormon                  senyawa organik yang dihasilkan di dalam tanaman, dalam konsentrasi rendah dapat meningkatkan, menghambat, atau secara kualitatif memodifikasi pertumbuhan tanaman pada bagian yang berbeda dari tempat sintesisnya.

In vitro                   secara harfiah berarti di dalam kaca, di dalam tabung reaksi, botol, dan sebagainya. Dalam kultur jaringan, diterapkan pada setiap proses yang dilakukan di dalam kultur steril

In vivo                        secara harfiah berarti ‘di dalam kehidupan’ , diterapkan pada setiap proses yang terjadi di dalam organisme utuh; tanaman utuh yang tumbuh baik di rumah kaca maupun di lapangan

Induksi                        inisiasi suatu proses tertentu yang menghasilkan perkembangan organ, misalnya induksi akar, pucuk, dan bunga

Infeksi                         terjadi penyakit akibat serangan mikroorganisme

Inisiasi                         pembentukan struktur suatu organ, seperti primordia akar atau pucuk

Inokulasi                      meletakkan inokulum di dalam atau pada medium nutrisi

Juvenil                       suatu fase dalam siklus hidup tanaman dimana pada periode tersebut pembungaan tidak dapat diinduksi, selama fase juvenil tanaman sering memperlihatkan karakteristik khusus

Kalus                           jaringan yang tumbuh dari proliferasi sel-sel yang belum terorganisasi-suatu kelompok sel tanaman yang belum terdiferensiasi

Kontaminan                 organisme penghambat pertumbuhan

Kultur                       menumbuhkan sel, jaringan, organ, ataupun keseluruhan tanaman di dalam medium steril dan kondisi aseptik, misalnya kultur sel, kultur embrio, kultur ujung pucuk, kultur antera, dan sebagainya

Kultur jaringan          istilah umum yang mengacu pada semua bentuk kultur aseptik jaringan tanaman ataupun hewan

LAFC              kotak yang digunakan untuk inokulasi eksplan, harus dijaga agar tetap steril dengan mengalirkan udara steril secara teratur dengan arah horizontal

Meristem                 kelompok sel yang sedang aktif tumbuh yang dilokalisir dari jaringan permanen, misalnya akar, pucuk, daun, atau bunga

Meristematik            memiliki karakteristik meristem

Mikropropagasi            perbanyakan tanaman seksual atau vegetatif secara in vitro

Morfogenesis               perkembangan bentuk dan struktur

MS                               Murashige dan Skoog (1962)

Mutasi                     perubahan jumlah atau struktur DNA di dalam suatu organisme menyebabkan terjadinya perubahan pada fenotip organisme tersebut

Otoklaf                alat yang digunakan untuk mensterilkan medium, gelas, dan lain-lain, dengan memanfaatkan uap bertekanan tinggi

Planlet                  pucuk kecil yang berakar atau embrio yang berkecambah

Primordia                     kelompok sel yang menumbuhkan suatu organ

Ruang kultur                suatu ruangan yang berfungsi sebagai tempat pemeliharaan kultur

Ruang steril                  ruang kerja untuk penanaman (inokulasi eksplan)

Skalpel                         pisau bedah kecil dan tajam yang digunakan untuk memotong bahan eksplan

Somatik                       mengacu pada bagian atau proses vegetatif

Steril                            media atau objek tanpa mikroorganisme yang viabel atau terlihat jelas

Sterilisasi                     prosedur eliminasi mikroorganisme, misal secara kimiawi, panas, radiasi

Subkultur                     subdivisi sutu kultur untuk ditransfer ke medium agar

Totipotensi           sifat suatu sel untuk berkembang, membelah diri, dan berdiferensiasi menjadi suatu organisme lengkap

UV                               ultraviolet (cahaya)

Vitamin                   kelompok senyawa organik yang kadang ditambahkan ke dalam medium kultur, misalnya vitaminB1, vitamin C, dan lainnya

Zat pengatur tumbuh          senyawa yang berperan mengatur pertumbuhan dan perkembangan sel, organ, dan sebagainya

Zigot                            Sel yang terbentuk dari penyatuan dua gamet

(Zulkarnain, 2010)