Beberapa Jenis Medium Kultur Jaringan

Keberhasilan teknik kultur jaringan terutama disebabkan pengetahuan yang lebih baik tentang kebutuhan hara sel dan jaringan yang dikulturkan. Hara terdiri dari komponen yang utama dan komponen tambahan. Komponen utama meliputi garam mineral, sumber karbon (gula), vitamin, dan pengatur tumbuh. Komponen lain seperti senyawa nitrogen organik, berbagai asam organik, metabolit dan ekstrak tambahan tidak mutlak, tetapi dapat menguntungkan ketahanan sel dan perbanyakannya (Wetter dan Constabel 1991). Media hara dapat berbentuk padat, semi padat, dan cair (Wattimena et al. 1992). 

Komposisi formulasi dari suatu media, harus mengandung nutrien esensial makro dan mikro serta sumber tenaga. Zat-zat tersebut bisa dicampur sendiri dari bahan dasarnya atau diperoleh sudah dalam bentuk campuran. Biasanya ditambah zat pengatur tumbuh, seperti hormon-hormon dan penyangga misalnya agar. Banyak formulasi media yang ada, masing-masing berbeda dalam hal kuantitas maupun kualitas komponennya. Dari sekian banyak formulasi yang ada, beberapa buah diantaranya telah sering dipakai. Antara lain seperti yang telah dikemukakan oleh Toshio Murashige dan dipublikasikan oleh Murashige dan Skoog pada tahun 1962 (Wetherell 1982).

            Media yang dipakai dalam kultur  jaringan telah banyak dikembangkan oleh beberapa peneliti. Di dalam media tersebut biasanya terkandung senyawa-senyawa kimia yang diperlukan oleh jaringan tanaman (Wattimena  et al.1986). Senyawa-senyawa kimia  yang terkandung dalam media disusun dalam perimbangan tertentu.  Perimbangan yang tepat dari senyawa penyusun tersebut perlu dan menentukan  tipe pertumbuhan yang akan terbentuk dari eksplan yang ditanam  (Wattimena  et al.1986).

Setiap media kultur mempunyai kespesifikan yang tertentu. Media Murashige dan Skoog (MS) merupakan media kultur yang umum digunakan para ahli karena dapat dipakai untuk mengulturkan berbagai macam tanaman, termasuk jati. Sementara itu, media Vacin dan Went (VW) merupakan media kultur yang khusus dipergunakan untuk anggrek  (Sandra 2003). Keistimewaan medium MS  adalah kandungan nitrat, kalium, dan amoniumnya yang tinggi (Wetter dan Constabel 1991).

Teknik Inokulasi Eksplan

Proses inokulasi eksplan dilakukan di laminar air flow dengan kondisi aseptik. Alat-alat inokulasi ditata di dalam laminar air flow. Setiap alat tersebut dicelupkan ke dalam alkohol 95% dan dilewatkan di atas nyala api bunsen selama 1 menit. Daun atau bagian tanaman lainnya dipotong ±1x1 cm dan  diinokulasikan ke dalam botol kultur yang telah berisi ± 20 ml medium  kultur dengan posisi bagian abaksial menyentuh medium (Dhaliwal et al., 2004).

Setelah eksplan diinokulasikan ke dalam botol kultur, botol ditutup rapat dan diberi label yaitu tanggal dilakukan inokulasi eksplan, konsentrasi hormon, dan perlakuan lainnya (bila dilakukan) yang digunakan yang selanjutnya diinkubasi di rak kultur selama 30 hari. Setiap kolom rak kultur diberi pencahayaan dengan lampu neon 40 watt dengan lama penyinaran 16 jam terang (Dhaliwal et al., 2004; Ali et al. 2003). Suhu ruang penyimpanan diatur relatif konstan 25^oC±1 (Dhaliwal et al., 2004). 

Senyawa Alkaloid

Alkaloid merupakan senyawa yang bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen dan biasanya berupa sistem siklis. Alkaloid mengandung atom karbon, hidrogen, nitrogen dan pada umumnya mengandung oksigen. Senyawa alkaloid banyak terkandung  dalam akar, biji, kayu maupun daun dari tumbuhan dan juga dari hewan. Senyawa alkaloid merupakan hasil metabolisme dari tumbuh–tumbuhan dan digunakan sebagai cadangan bagi  sintesis protein. Kegunaan alkaloid bagi tumbuhan adalah sebagai pelindung dari serangan hama, penguat tumbuhan dan pengatur kerja  hormon. Familia tanaman yang mengandung alkaloid adalah Liliaceae, Solanaceae, Rubiaceae, dan Papaveraceae (Tobing, 1989 dalam Susilowati, 2006).

Alkaloid diekstrak dari tumbuhan yaitu daun, bunga, buah, kulit, dan akar yang dikeringkan lalu dihaluskan. Cara ekstraksi alkaloid secara umum adalah sebagai berikut :

1. Alkaloid diekstrak dengan pelarut  tertentu, misalnya dengan etanol, kemudian diuapkan.
2. Ekstrak yang diperoleh diberi asam anorganik untuk menghasilkan garam amonium kuartener kemudian diekstrak kembali.
3. Garam amonium kuartener yang diperoleh direaksikan dengan natrium karbonat sehingga menghasilkan alkaloid–alkaloid yang bebas kemudian diekstraksi dengan pelarut tertentu seperti eter dan kloroform.
4. Campuran–campuran alkaloid yang diperoleh akhirnya dipisahkan melalui berbagai cara, misalnya metode kromatografi

Cekaman Kekeringan Pada Kultur In Vitro

Seleksi  in vitro untuk mendapatkan varian yang toleran terhadap kekeringan dapat menggunakan agens seleksi berupa senyawa osmotik. Senyawa ini dapat menyimulasi kondisi kekeringan di lapangan. Senyawa osmotik yang paling banyak digunakan dalam simulasi cekaman kekeringan adalah  polyethylene glycol (PEG) (Yusnita, 2009). Senyawa PEG bersifat larut dalam air dan dapat menyebabkan penurunan potensi air secara homogen. Besarnya penurunan air sangat bergantung pada konsentrasi dan berat molekul PEG. Keadaan seperti ini dapat dimanfaatkan untuk melakukan simulasi penurunan potensial air yang mencerminkan cekaman kekeringan bagi tanaman (Michel dan Kaufmann 1973 dalam Yusnita 2009).  Potensial osmotik media tumbuh  merupakan faktor penting yang berpengaruh terhadap proses pembentukan embrio somatik dalam kultur in vitro. Penurunan potensial air media karena penambahan PEG menyebabkan menurunnya proliferasi jaringan eksplan, pertumbuhan dan regenerasi tunas (Kong  et al., 1998 dalam Sumarjan, 2009).

Penggunaan PEG sebagai media seleksi tidak membahayakan tanaman karena mempunyai berat molekul lebih besar dari 4.000. Dengan demikian, kerusakan atau kematian tanaman pada simulasi menggunakan senyawa PEG diyakini sebagai efek kekeringan, bukan efek langsung dari senyawa PEG karena senyawa tersebut tidak diserap oleh tanaman (Dami dan Hughes 1997).

Sesuai dengan Widoretno (2003), kalus yang diseleksi dengan PEG (0-20%) menunjukkan semakin tinggi konsentrasi PEG yang diberikan maka semakin sedikit pula jumlah struktur embrio somatik yang diperoleh. Hal ini terjadi karena pada media seleksi kekurangan atau bahkan tidak memperoleh air karena air terikat oleh PEG(>30%) dan tidak dapat dimanfaatkan oleh eksplan. Sulitnya air masuk ke dalam sel makin besar dengan meningkatnya konsentrasi PEG.

Senyawa PEG yang digunakan untuk menginduksi cekaman kekeringan pada tanaman anggur secara in vitro menghasilkan kutikula yang lebih tinggi pada permukaan daunnya dibandingkan kontrol (Dami dan Hughes, 1997).  Tanaman anggur yang dikulturkan secara PEG juga menunjukkan jaringan mesofil daun yang lebih tipis dibandingkan tanaman kontrol yang dikulturkan secara in vitro (Dami dan Hughes, 1995). Hal yang perlu diperhatikan adalah pengaruh PEG pada eksplan bergantung pada jenis eksplan serta konsentrasi PEG yang digunakan (Sumarjan, 2009).

Lingkungan Kultur

Faktor-faktor fisik lingkungan kultur harus dipenuhi, karena dapat mempengaruhi proses pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Faktor-faktor fisik yang dimaksud adalah:

a.      Cahaya

            Intensitas cahaya yang rendah dapat mempertinggi embriogenesis dan organogenesis. Cahaya ultraviolet dapat mendorong pertumbuhan dan pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intensitas rendah sedangkan pada intensitas tinggi proses ini akan terhambat. Pembentukan kalus maksimum sering terjadi di tempat yang lebih gelap (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Menurut Yusnita (2003), secara umum intensitas cahaya yang optimum untuk tanaman pada tahap inisiasi kultur adalah 40 Watt.

b.      pH

Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H⁺ dalam larutan (Hendaryono dan Wijayani, 1994). pH merupakan variable penting dalam media. Sel-sel tanaman dalam budidayanya secara in vitro memerlukan pH asam, dan kisaran pH optimumnya adalah antara 5,5 hingga 5,8 (Santoso dan Nursandi, 2003). George dan Sherrington (1984) dalam Fitrianti (2006), mengatakan bahwa manfaat pH dalam medium adalah untuk menjaga kestabilan membran sel, mengatur garam-garam mineral agar tetap dalam bentuk terlarut dan untuk membantu penyerapan hara. Yusnita (2003), menyebutkan bahwa pH diatur sebelum diautoklaf dengan nilai pH sekitar 5,8 dengan menggunakan pH meter dan biasanya dalam medium ditambahkan NaOH atau HCl sebagai buffer. Jika pH mula-mula lebih tinggi dari 5,8 larutan ditetesi dengan HCl, sedangkan jika lebih rendah ditetesi dengan NaOH.

c.       Temperatur

            Suhu yang dibutuhkan untuk dapat terjadi pertumbuhan yang optimum dalam kultur in vitro umumnya adalah berkisar antara 20°-30°C (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Temperatur antara 26-28°C merupakan keadaan dimana tanaman akan bertahan dengan berbagai cara dan melakukan pertumbuhan maksimum

d.      Kelembaban Relatif

            Kelembaban merupakan faktor penting yang menentukan keberhasilan kultur in vitro berbagai spesies tanaman. Kelembaban relatif dalam ruang kultur sekitar 70%, namun kebutuhan kelembaban di dalam wadah kultur mendekati 90% (Zulkarnain, 2009). Wetherell (1982) dalam Fitrianti (2006), mengemukakan bahwa kelembaban ruangan yang rendah akan menyebabkan penguapan air dari media kultur akan terlalu besar. Sebaliknya, kelembaban ruang kultur yang tinggi akan menaikkan derajat kontaminasi.