Sterilisasi Dan Inokulasi Eksplan (Daun Krisan)

Eksplan: daun muda tanaman krisan (Chrysanthemum indicum). 

Pemilihan eksplan ini didasarkan atas banyaknya jaringan meristem pada suatu organ tumbuhan muda dimana jaringan meristem inilah yang aktif membelah dan akhirnya terdiferensiasi menjadi jaringan tumbuhan lain yang pada akhirnya akan membentuk organ tumbuhan (Zulkarnain, 2009). Eksplan daun krisan selanjutnya dicuci dengan air mengalir sembari digosok permukaannya dengan menggunakan sikat halus. Hal ini bertujuan untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi karena permukaan daun krisan mengandung kutikula dimana hal tersebut dapat diketahui dari teksturnya yang kasar dan berbulu. Pencucian eksplan daun krisan ini merupakan sterilisasi eksplan tahap pertama.

            Eksplan daun yang telah dicuci selanjutnya dibawa ke laminair air flow untuk dilakukan sterilisasi tahap kedua. Eksplan daun direndam dalam etanol 70% selam 30 detik untuk melunakkan dinding sel pada daun sehingga sterilan berikutnya dapat masuk ke dalam jaringan eksplan dan menghilangkan kontaminan yang ada dalam jaringan. Karena menurut Gunawan (1987), kontaminan tidak hanya dapat berasal dari permukaan luar eksplan, tetapi juga dari dalam jaringan eksplan. Selanjutnya eksplan direndam dalam larutan clorox 1% dan dibilas dengan aquades steril. Larutan clorox ini adalah salah satu larutan sterilan dimana penggunaannya pada sterilisasi eksplan termasuk sterilisasi ringan. Menurut Gunawan (1987) berdasarkan senyawa kimia yang digunakan, sterilisasi eksplan dibedakan menjadi tiga, yaitu:

• 1.      Sterilisasi Ringan

Eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali. 

• 2.      Sterilisasi Sedang

Eksplan direndam dalam HgCl₂ 0.1-0.5 mg/l selama 7 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali.  

• 3.       Sterilisasi Keras

Eksplan direndam dalam HgCl₂ 0.1-0.5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril.  Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali.   

Selain berdasarkan jenis senyawa kimianya, sterilisasi eksplan dibedakan menjadi sterilisasi kimia dan mekanik. Sterilisasi kimia adalah sterilisasi ekaplan dengan menggunakan senyawa kimia seperti clorox ataupun sublimat dimana sterilisasi ini digunakan pada eksplan yang teksturnya lunak seperti daun atau nodus. Sedangkan sterilisasi mekanik merupakan teksnik sterilisasi eksplan yang dilakukan dengan melukai eksplan (skarifikasi) dimana material eksplan yang digunakan bersifat keras, seperti biji salak atau kelengkeng. Teknik sterilisasi mekanik ini, selain untuk menghilangkan kontaminan dilakukan juga untuk mematahkan dormansi pada biji (Salisbury dan Ross, 1995). Dari penjabaran tersebut maka dapat dikatakan bahwa sterilisasi yang digunakan pada eksplan krisan ini merupakan sterilisasi kimiawi dengan larutan clorox 1% sebagai bahan sterilannya. Suhu 121°C. Sterilisasi ini merupakan sterilisasi dengan menggunakan uap air sehingga dinamakan sterilisasi uap basah (Waluyo, 2008). Setelah diautoclave, alat-alat disterilisasi dengan sinar UV yang ada pada laminair air flow selama 1 jam penuh dimana ketika lampu UV dinyalakan, tirai LAF ditutup rapat. Selain itu dilakukan pula sterilisasi secara langsung terhadap alat-alat inokulasi dimana setiap kali hendak digunakan alat-alat inokulasi dilalukan di atas api bunsen. Teknik sterilisasi yang demikian dinamakan sterilisasi panas kering. Pada alat inokulasi dilakukan pula sterilisasi secara kimiawi dimana setelah digunakan untuk memberikan perlakukan pada eksplan, misalnya memotong eksplan, alat tersebut dicelupkan ke dalam larutan etanol atau alkohol 90% selama satu menit.

Setelah melalui tahap sterilisasi tersebut, eksplan daun krisan selanjutnya ditiriskan di atas kertas saring dan dipotong kecil-kecil dengan ukuran 1 x 1 cm². Pemotongan eksplan dilakukan setelah sterilisasi dikarenakan konsentrasi sterilan tersebut dikhawatirkan terlalu pekat bagi jaringan eksplan yang telah dipotong sehingga eksplan tidak lagi hidup (mati). Eksplan tersebut kemudian dinokulasikan ke dalam medium MS dengan bagian abaksial daun menyentuh permukaan medium. Hal ini dikarenakan pada bagian baksial, letak jaringan pengangkut lebih dekat dengan permukaan dibandingkan bagian adaksial (atas) daun dimana pada bagian adaksial setelah jaringan epidermis terdapat jaringan mesofil sehingga penyerapan unsur hara dari medium dapat berlangsung optimal. Setelah inokulasi selesai, eksplan diinkubasi di ruang kultur selama 21 hari untuk mengetahui pengaruh ZPT yang telah diberikan pada medium. Pengamatan 21 hari ini merupakan waktu minimum bagi eksplan untuk melakukan suatu pertumbuhan yang dalam hal ini adalah membentuk kalus.